由於遺傳特性不同，適合各種微生物的保存方法也不同。一種良好有效的保存方法，首先要能長期保持原菌種的優異性質不變，同時還要考慮方法的通用性、操作的簡單性和設備的普及性。以下是ATCC菌株的一些常用保存方法:

　　(一)斜麵低溫保存法

　　將菌種接種在合適的斜麵培養基上，待菌種完全生長後，放入4℃左右的冰箱中保存，每隔一段時間(保存期)轉移到新的斜麵培養基上，生長後繼續保存，如此持續。

　　這種方法廣泛應用於大多數微生物菌種的短期保存，如細菌、放線菌、酵母菌和黴菌，不適合冷凍和幹燥。放線菌、黴菌和有芽孢的細菌一般可以保存6個月左右，無芽孢的細菌可以保存1個月左右，酵母可以保存3個月左右。如果用橡皮塞代替棉塞，用石蠟密封，放在4℃的冰箱裏保存，不僅可以防止水分揮發和隔氧，還可以防止棉塞受潮和汙染。這種改進可以延長菌種的保質期。

　　由於該方法采用低溫保存，微生物代謝繁殖速度大大降低，突變頻率降低;同時也減少了培養基的水分蒸發，使其不會幹裂。這種方法的優點是簡單易行，易於推廣，存活率高。因此，這種保存方法大多用於科學研究和生產中經常使用的菌種。它的缺點是菌株仍然具有一定程度的代謝活動能力，保存期短，傳代次數多，菌株容易發生變異和汙染。

　　(二)石蠟油密封法

　　這種方法是將滅菌、蒸發水分的液體石蠟倒入培養成熟的菌種斜麵(或半固體穿刺培養物)上，石蠟油層高於斜麵頂部的lcm，使培養物與空氣隔離，加入膠塞，用固體石蠟密封，然後垂直存放在室溫或4℃的冰箱中。使用的液體石蠟需要優質、無毒、純化學規格，滅菌條件如下:150～170℃烘箱內滅菌lh;或者121℃高壓蒸汽滅菌60℃～80min，然後放在80℃的烤箱裏烘幹去除水分。

　　因為液體石蠟阻擋了空氣，使細菌處於缺氧狀態，防止水分揮發，使培養物不會開裂，因此可以使保質期達到1。～兩年，或者更長。

　　這種方法操作簡單，適用於保存黴菌、酵母、放線菌、好氧細菌等。它對保存黴菌和酵母有很好的效果，可以保存幾年甚至10年。然而，它對許多厭氧細菌的保存效果很差，尤其是對一些能分解烴類的細菌。

　　根據實驗，這種方法適合保存紅曲黴，保存1～22年後的存活率為100%;還有報道顯示，部分細菌絲采用石蠟油保存法，3～菌絲在6℃保存時容易死亡，而在室溫下則比較理想，值得注意。

　　(三)砂土管保存法

　　這是一種常用的長期保存菌種的方法，適用於放線菌、黴菌和形成孢子的細菌，但不適用於奈氏球菌、弧菌、假單胞杆菌、酵母等一些對幹燥敏感的細菌。

　　製作方法是先將砂和土分別清洗、幹燥、過篩(一般砂采用60目篩，土采用120目篩)，按砂與土的比例(1。～2)：1混合均勻，分裝在小試管中，砂土高度約1cm，蒸汽滅菌121℃。～1.5h，間歇殺菌3次。50℃幹燥後，檢查正確後備用。也有隻用沙子或土壤作為載體保存的。需要保存的菌株先用斜麵培養基充分培養，再用無菌水製成108～1010/ml菌懸液或孢子懸液滴入砂管中，放線菌和黴菌也可以直接刮下孢子與載體混合，然後放入幹燥器中抽真空約2。～四小時內，用火焰熔封管口(或用石蠟封口)，放置在幹燥器內，保存在室溫或4℃的冰箱內，後者效果更好。

　　砂管法兼具低溫、幹燥、隔氧、無營養等條件，因此保質期長，效果好，微生物移接方便，經濟簡單。它的保質期比石蠟油密封法長，大約1。～十年。**科學院微生物研究所采用砂土管保存法保存放線菌。

　　(四)麩皮保存法

　　麩皮保存法又稱曲法保存法。也就是說，它以麩皮為載體，吸附接入的孢子，然後在低溫幹燥條件下保存。製作方法是將麩皮和水按一定比例按照不同菌種對水的要求進行1。：(0.8～1.5)攪拌均勻，裝量為試管體積的2/5。濕熱滅菌後，冷卻，接入新鮮培養的菌種，適溫培養至孢子生長。將試管放入含有氯化鈣等幹燥劑的幹燥器中，在室溫下幹燥幾天，然後移至低溫保存;幹燥後，試管也可以用火焰熔封，然後保存，這樣效果更好。

　　這種方法適用於孢子黴菌和一些放線菌的產生，保存期超過一年。由於操作簡單，經濟實惠，廣泛應用於工廠。**科學院微生物研究所采用麩皮保存法保存曲黴，如米曲黴、黑曲黴、泡曲黴等。，其保存期可達數年至數十年。

　　(五)甘油懸液保存法

　　這種方法是將菌種懸浮在甘油蒸餾水中，低溫保存。這種方法比較簡單，但是需要配備低溫冰箱。如果保存溫度為-20℃，保存期約為0.5。～一年，而采用-70℃，保質期可達10年。

　　將擬保存菌種對數期的培養液直接與甘油混合，甘油經121℃蒸汽滅菌20分鍾，甘油濃度為10%。～15%，再分裝在小離心管裏，放在低溫冰箱裏保存。這種方法經常用於基因工程細菌的保存。

　　(六)冷凍真空幹燥保存法

　　冷凍真空幹燥保存法，又稱冷凍幹燥保存法，簡稱冷凍幹燥法。它通常用保護劑在安瓿管中製備細胞懸液或孢子懸液，然後在低溫下快速冷凍含菌樣品，減壓抽真空，使水升華幹燥樣品脫水，形成完全幹燥的固體菌塊。並在真空條件下立即密封，導致無氧真空環境。*放在低溫下，使微生物處於休眠狀態，可長期保存。常用的保護劑包括脫脂牛奶、血清、澱粉、葡聚糖等高分子物質。

　　因為這種方法同時具有低溫、幹燥、缺氧的菌種保存條件，所以保存期長，一般達到5。～15年來，存活率高，變異率低，是目前廣泛使用的理想保存方法。這種保存方法可用於大多數其他微生物，如病毒、細菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等。，除了不產生孢子的絲狀真菌。但是這種方法操作繁瑣，技術要求高，需要凍幹機等設備。

　　當需要保存菌種時，可以在無菌環境下打開安瓿管，將無菌培養基注入安瓿管。固體菌塊溶解後，搖勻複水，然後在適合菌種生長的斜麵上接種，適當溫度培養。

　　(七)液氮超低溫保存法

　　液氮超低溫保存法，簡稱液氮保存法或液氮保存法。它是以甘油、二甲基亞邈等為保護劑，在液氮超低溫(-196℃)下保存的一種方法。其主要原理是菌種細胞從常溫過渡到低溫，使細胞內的自由水在降低到低溫前通過細胞膜滲出，避免細胞因自由水凝結成冰晶而損傷膜內的細胞。當美國ATCC菌種保存中心采用這種方法時，通過控製菌懸液或帶菌絲的瓊脂塊的冷卻速度，每分鍾降低1℃/分鍾的速度從0℃降至-35℃，然後保存在-150℃。～-196℃液氮冷箱。如果冷卻速度太快，冰晶會損傷細胞，因為細胞內的自由水沒有時間滲出細胞。據研究，冷卻速度控製在(1)～10)℃/min，細胞性死亡率低;死亡率隨著速度的加快而相應增加。

　　低溫保存液氮的保護劑一般選用甘油、二甲基亞邈、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊環、吐溫80等，但常用甘油(10%)～20%)。不同的微生物應該選擇不同的保護劑，然後通過實驗確定保護劑的濃度。原則上，保護劑的濃度應控製在不足以導致微生物死亡的濃度。

　　這種方法操作簡單、高效、保存期一般可達15年以上，是目前公認的*有效菌種長期保存技術之一。該方法適用於保存各種微生物菌種，甚至藻類、原生動物、支原體等。用於有效保存。這種方法的另一個主要優點是可以用各種培養形式的微生物來保存，這種保存方法可以用於孢子或菌體、液體培養物或固體培養物。其缺點是需要購買超低溫液氮設備，液氮消耗大，運行成本高。

　　使用菌種時，將安瓿瓶從液氮罐中取出，迅速放入35～在40℃的溫水中，冷凍熔化，無菌操作打開安瓿瓶，移到保存前使用的同一培養基的斜麵上進行培養。從液氮罐中取出安瓿瓶時，速度要快，一般不超過1分鍾，防止其他安瓿瓶升溫，影響保存質量。而且取樣時一定要戴專用手套，防止意外爆炸和凍傷。

　　(八)宿主保存法

　　這種方法適用於專用活細胞寄生微生物(如病毒、立克次氏體等)。).它們隻能寄生在活動植物或其他微生物體內，因此可以根據宿主細胞的特性進行保存。例如，植物病毒可以通過混合植物幼葉的汁液、冷凍或幹燥來保存。噬菌體可以通過細菌培養擴大後直接與培養基混合保存。動物病毒可以直接用病毒感染合適的器官或體液，然後裝入試管中密封，低溫保存。

　　在上述菌種保存方法中，以斜麵低溫保存方法、石蠟油密封方法、宿主保存方法*為簡單，其次是砂管保存方法、麩皮保存方法和甘油懸液保存方法;冷凍真空幹燥保存方法和液氮超低溫保存方法複雜，但保存效果好。應用時可根據實際需要選擇。

　　“美國典型培養物收藏中心”(簡稱ATCC)是國際著名的“美國典型培養物收藏中心”，隻采用兩種有效的保存方法，即保存期一般達到5。～15年冷凍真空幹燥保存法和液氮超低溫保存法一般達到15年以上的保存期，以大限度地減少傳代次數，避免菌種變異和衰退。中國的菌種保存多采用三種方法，即斜麵低溫保存法、液氮超低溫保存法和冷凍真空幹燥保存法。